Dane oryginału:

Enzymes in Food Technology

Edited by Robert J.Whitehurst and Maarten Van Oort

All rights reserved. Autorised translation from the English language edition published

by Jahn Wiley & Sons Limited. Responsibility for the accuaracy of the translation rests solely

with WYDAWNICTWO NAUKOWE PWN, VAT PL5260152235 and is not the responsibility

of Jahn Wiley & Sons Limited. No part of this book may be reproduces in any form without

the written permission of the oryginal copyright holder, Jahn Wiley & Sons Limited.

Z języka angielskiego tłumaczyła Agnieszka Błaszczak

Projekt okładki i stron tytułowych Bartosz Dobrowolski

Wydawca Katarzyna Włodarczyk-Gil

Redaktor prowadzący Iwona Lewandowska

Redaktor naukowy Halina Kalinowska

Produkcja Mariola Grzywacka

Książka, którą nabyłeś, jest dziełem twórcy i wydawcy. Prosimy, abyś przestrzegał praw

im przysługujących. Jej zawartość możesz udostępnić nieodpłatnie osobom bliskim

lub osobiście znanym. Jednak nie publikuj jej w Internecie. Jeśli cytujesz jej fragmenty, nie zmieniaj

ich treści i koniecznie zaznacz, czyje to dzieło. A kopiując jej część, rób to jedynie na użytek osobisty.

Szanuj cudzą własność i prawo.

Więcej na www.legalnakultura.pl

Polska Izba Książki

Copyright © for the Polish edition by Wydawnictwo Naukowe PWN SA Warszawa 2016

eBook został przygotowany na podstawie wydania papierowego z 2016 r., (wyd. I)

ISBN 978-83-01-19044-6

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

infolinia 801 33 33 88

tel. 22 69 54 321; faks 22 69 54 288

e-mail: pwn@pwn.com.pl; reklama@pwn.pl

www.pwn.pl

Spis treści

Strona tytułowa

Strona redakcyjna

Spis treści

Autorzy

Słowo wstępne

1. Wprowadzenie: Enzymy w przemyśle spożywczym

1.1. Historia

1.2. Nazewnictwo

1.3. Enzymologia

1.3.1. Funkcje enzymów w naturze

1.3.2. Chemia enzymów

1.3.3. Specyficzność enzymów

1.3.3.1. Model klucza i zamka

1.3.3.2. Model indukowanego dopasowania

1.3.4. Mechanizmy działania

1.3.5. Kompleks enzym–substrat

1.3.6. Równowaga chemiczna

1.4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

1.5. Czynniki wpływające na aktywność enzymów

1.5.1. Stężenie enzymu

1.5.2. Stężenie substratu

1.5.3. Allosteria

1.5.4. Kofaktory

1.5.5. Koenzymy

1.5.6. Inhibitory

1.5.6.1. Inhibicja kompetycyjna

1.5.6.2. Inhibicja akompetycyjna

1.5.6.3. Inhibicja niekompetycyjna

1.5.6.4. Inhibicja mieszana

1.6. Enzymy przemysłowe

1.7. Enzymy stosowane w produkcji żywności

1.7.1. Biotechnologia żywności

1.7.2. Zastosowania enzymów w produkcji żywności

1.8. Inżynieria genetyczna

1.9. Alergie powodowane przez enzymy

1.10. Podsumowanie i wnioski

Bibliografia

2. GMO a inżynieria białek

2.1. Wprowadzenie

2.2. Technologia rekombinowanego DNA

2.2.1. Klonowanie metodą „shotgun”

2.2.2. Samoklonowanie

2.2.3. Klonowanie z zastosowaniem PCR

2.2.4. Przykłady zastosowań

2.2.4.1. Przykład 1: wydajna produkcja fosfolipazy D ze Streptomyces cinnamoneum z użyciem technologii rekombinowanego DNA

2.2.4.2. Przykład 2: ekspresja fosfolipazy A2 ze Streptomyces violaceoruber

2.2.4.3. Przykład 3: klonowanie i ekspresja genu sfingomielinazy ze Streptomyces cinnamoneus przy użyciu PCR

2.3. Inżynieria białek

2.3.1. Strategie inżynierii białek

2.3.1.1. Metody racjonalnej mutagenezy

2.3.1.2. Mutageneza przypadkowa

2.3.2. Systemy ekspresji genów

2.3.3. Selekcjonowanie i monitorowanie

2.3.3.1. Wysoko wydajne badania przesiewowe

2.3.4. Zastosowania inżynierii białek – niezwykle skuteczne narzędzie przy wytwarzaniu enzymów stosowanych jako biokatalizatory

2.3.4.1. Przykłady poprawiania termostabilności oraz zmiany optymalnego pH działania

2.3.4.2. Przykład zwiększania wydajności katalitycznej

2.3.4.3. Przykład zmiany specyficzności substratowej

2.3.4.4. Przykłady zmian selektywności

2.3.5. Kwestie bezpieczeństwa

2.4. Regulacje prawne

2.4.1. Przepisy dotyczące samoklonowania

2.4.2. Klonowanie oraz ekspresję genów między Streptomyces należy traktować jak „samoklonowanie”

2.5. Perspektywy na przyszłość

Podziękowania

Bibliografia

3. Wytwarzanie enzymów przemysłowych

3.1. Badania aplikacyjne i inżynieria białek

3.2. Opracowywanie szczepów

3.2.1. Wprowadzenie

3.2.2. GMO wobec nie-GMO

3.2.3. Przykład: konstrukcja szczepu Bacillus subtilis jako gospodarza produkcji

3.2.4. Cele inżynierii genetycznej

3.2.5. Produkcja enzymów dla przemysłu spożywczego w dobie „omik”

3.3. Fermentacja mikrobiologiczna

3.3.1. Utrzymywanie i przechowywanie kultur

3.3.2. Przygotowywanie inokulum

3.3.3. Fermentacja produkcyjna

3.3.3.1. Sterylizacja

3.3.3.2. Przenoszenie masy i ciepła

3.3.3.3. Wzrost katalizatora

3.3.3.4. Produkcja enzymu (związana i niezwiązana ze wzrostem)

3.3.3.5. Produkcja okresowa, półciągła i ciągła

3.4. Procesy wydzielania i oczyszczania

3.4.1. Wypełnianie luk

3.4.2. Podstawowy proces wydzielania i oczyszczania

3.4.3. Oczyszczanie

3.4.4. Zrównoważenie procesów produkcji

3.5. Formulacja enzymów

3.5.1. Przygotowanie produktów stałych

3.5.1.1. Suszenie rozpyłowe

3.5.1.2. Kapsułkowanie

3.5.1.3. Tabletki enzymatyczne

3.5.2. Przygotowanie produktów płynnych

3.5.3. Mieszanki

3.5.4. Środki konserwujące

3.6. Podsumowanie

Bibliografi

4. Asparaginaza – enzym redukujący zawartość akryloamidu w produktach spożywczych

4.1. Wprowadzenie

4.2. Asparaginaza

4.3. Oznaczanie zawartości akryloamidu

4.4. Zastosowania

4.4.1. Próby zastosowania w produktach zbożowych

4.4.1.1. Półsłodkie ciasteczka

4.4.1.2. Precle

4.4.1.3. Chrupki chleb

4.4.1.4. Ciasteczka imbirowe

4.4.1.5. Profile aromatu

4.4.1.6. Wnioski – wpływ asparaginazy na produkty zbożowe

4.4.2. Badania zastosowań w produktach ziemniaczanych

4.4.2.1. Wprowadzanie asparaginazy do przetwórstwa ziemniaków

4.4.2.2. Produkcja przemysłowa frytek

4.4.2.3. Laboratoryjne badanie wpływu asparaginazy na frytki

4.4.2.4. Badania pilotażowe frytek

4.4.2.5. Talarki ziemniaczane

4.4.2.6. Ograniczenia działania asparaginazy

4.4.2.7. Produkty ziemniaczane na bazie ciasta

4.4.2.8. Wnioski końcowe – asparaginaza w produktach na bazie ziemniaków

4.4.3. Zastosowania w obróbce kawy

4.4.3.1. Stosowanie asparaginazy w przetwarzaniu kawy

4.4.3.2. Badania laboratoryjne

4.4.3.3. Podsumowanie – asparaginaza w produkcji kawy

Podziękowania

Bibliografia

5. Zastosowanie enzymów w produkcji wyrobów mleczarskich

5.1. Wprowadzenie

5.2. Enzymy ścinające mleko

5.2.1. Natura i podobieństwo podpuszczki i koagulantów

5.2.2. Właściwości podpuszczki i koagulantów z różnych źródeł

5.2.3. Wytwarzanie podpuszczki i koagulantów

5.2.4. Formulacja i standaryzacja podpuszczki i koagulantów

5.3. Laktoperoksydaza

5.4. Enzymy uczestniczące w dojrzewaniu sera

5.4.1. Komercyjnie dostępne rodzaje enzymów

5.4.2. Technologia dodawania enzymów

5.4.3. Technologia produkcji serów modyfikowanych enzymatycznie

5.5. Lizozym

5.6. Transglutaminaza

5.7. Lipaza

5.7.1. Lipolizowany tłuszcz mleczny (LMF)

5.7.2. Między- i wewnątrzcząsteczkowa modyfikacja tłuszczu mlecznego katalizowana przez lipazy

5.8. Laktaza

5.8.1. Komercyjne produkty mleczarskie, otrzymywane przy użyciu technologii laktazy

Bibliografia

6. Enzymy w piekarnictwie

6.1. Wprowadzenie

6.1.1. Pszenica

6.1.2. Składniki mąki pszennej

6.1.3. Skrobia

6.1.4. Gluten

6.1.5. Polisacharydy nieskrobiowe

6.1.6. Lipidy

6.2. Enzymy wykorzystywane w produkcji pieczywa

6.2.1. Amylazy

6.2.2. Klasyfikacja

6.2.3. Amylazy w wytwarzaniu pieczywa

6.2.4. Inne amylazy

6.2.5. Enzymy zapobiegające czerstwieniu pieczywa

6.3. Ksylanazy

6.3.1. Klasyfikacja

6.3.2. Mechanizm działania

6.3.3. Ksylanazy w produkcji pieczywa

6.4. Lipazy

6.4.1. Mechanizm działania

6.4.2. Lipazy w produkcji pieczywa

6.5. Oksydoreduktazy

6.5.1. Klasyfikacja

6.5.2. Oksydazy w piekarnictwie

6.6. Proteazy

6.6.1. Klasyfikacja

6.6.2. Proteazy w piekarnictwie

6.6.2.1. Smak pieczywa

6.6.2.2. Utrzymywanie świeżości

6.7. Inne enzymy

6.7.1. Transglutaminaza

6.7.1.1. Transglutaminaza w pieczywie bezglutenowym

6.7.2. Endoglikozydazy

6.7.3. Celulazy

6.7.4. Mannanazy

6.8. Uwagi końcowe

Bibliografia

7. Enzymy w produkcji żywności innej niż pieczywo, opartej na pszenicy

7.1. Wprowadzenie

7.2. Funkcjonalność enzymów w produktach na bazie pszenicy, innych niż pieczywo

7.3. Zastosowanie enzymów w produkcji ciast i mufin

7.4. Zastosowanie enzymów w produkcji makaronów

7.4.1. Wpływ enzymów na makarony typu pasta

7.4.2. Wpływ enzymów na makarony ze zwykłej mąki (typu noodles)

7.5. Zastosowanie enzymów w produkcji ciastek, herbatników i krakersów

7.6. Zastosowanie enzymów w produkcji wafli

7.7. Wykorzystanie enzymów w produkcji tortilli na bazie mąki pszennej

7.8. Zastosowanie enzymów w produkcji płatków śniadaniowych

7.9. Inne przykłady

7.9.1. Wykorzystanie asparaginazy w celu zmniejszenia zawartości akryloamidu w produktach na bazie pszenicy

Bibliografia

8. Warzenie piwa z udziałem enzymów

8.1. Wprowadzenie

8.2. Słodowanie: przekształcanie surowego jęczmienia w kompleks bogaty w enzymy

8.2.1. Namaczanie

8.2.2. Kiełkowanie

8.2.2.1. Rozpad ściany komórkowej podczas kiełkowania

8.2.2.2. Rozpad białek podczas kiełkowania

8.2.2.3. Rozpad lipidów podczas kiełkowania

8.2.2.4. Rozpad skrobi podczas kiełkowania

8.2.2.5. Wykorzystanie egzogennego kwasu giberelinowego podczas kiełkowania

8.2.3. Suszenie

8.2.4. Komercyjne enzymy wykorzystywane w procesie słodowania

8.3. Proces przetwarzania w warzelniach

8.3.1. Mielenie

8.3.2. Zacieranie

8.3.2.1. Rozkład białek

8.3.2.2. Rozkład β-glukanu oraz innych nieskrobiowych polisacharydów

8.3.2.3. Komercyjne enzymy stosowane do rozkładu ściany komórkowej

8.3.2.4. Konwersja i amyloliza skrobi

8.3.2.5. Programy zacierania

8.3.3. Zakwaszanie biologiczne podczas zacierania

8.3.4. Enzymy wykorzystywane przy filtrowaniu zacieru

8.4. Składniki pomocnicze przy warzeniu piwa

8.4.1. Warzenie z udziałem surowego jęczmienia

8.4.2. Warzenie z użyciem kukurydzy lub ryżu

8.4.3. Warzenie z udziałem sorgo

8.4.4. Inne potencjalne dodatki

8.5. Zastosowania enzymów i ich rola w procesie fermentacji

8.5.1. Procesy enzymatyczne podczas fermentacji z udziałem drożdży

8.5.2. Enzymy egzogenne wykorzystywane podczas fermentacji

8.5.3. Wytwarzanie piwa o małej zawartości węglowodanów

8.6. Stabilizacja piwa

8.6.1. Enzymy wykorzystywane do działań naprawczych (filtracja a zmętnienie piwa)

8.6.2. Wzmocnione dojrzewanie

8.7. Enzymy w piwowarstwie – perspektywy na przyszłość

8.8. Wnioski końcowe

Podziękowania

Bibliografia

9. Wykorzystanie enzymów w produkcji alkoholi spożywczych oraz win

9.1. Enzymy wykorzystywane w produkcji alkoholi spożywczych

9.1.1. Enzymy hydrolizujące skrobię

9.1.1.1. α-Amylazy

9.1.1.2. β-Amylazy

9.1.1.3. Dekstrynazy graniczne

9.1.1.4. R-enzym

9.1.1.5. Glukoamylaza (amyloglukozydaza)

9.1.1.6. α-Glukozydaza

9.1.1.7. Transglukozydaza

9.1.2. Celulazy

9.2. Enzymy w przemyśle winiarskim

9.2.1. Wprowadzenie

9.2.2. Struktura i budowa winogron

9.2.3. Pektyny

9.2.3.1. Trzy główne składniki pektyn [13, 14]

9.2.3.2. Właściwości fizyczne pektyn i ich negatywny wpływ na produkcję win

9.2.4. Polifenole

9.2.4.1. Rodzaje związków fenolowych występujących w winogronach

9.2.4.2. Właściwości polifenoli

9.2.4.3. Rozmieszczenie polifenoli w winogronach

9.2.5. Aromaty do win i ich prekursory w winogronach

9.2.5.1. Składniki glikozylowane

9.2.5.2. Tiole

9.2.6. Aspekty prawne dotyczące stosowania enzymów w przemyśle winiarskim

9.2.6.1. Organizacje

9.2.6.2. Aktywności enzymatyczne dopuszczone w przemyśle winiarskim

9.2.6.3. Identyfikowalność

9.2.6.4. Oznaczanie

9.2.7. Jawność GMO

9.2.8. Wytwarzanie enzymów przeznaczonych dla winiarstwa

9.2.8.1. Enzymy powstałe w wyniku fermentacji

9.2.8.2. Inne sposoby wytwarzania enzymów dla przemysłu winiarskiego

9.2.9. Skład enzymów przeznaczonych dla przemysłu winiarskiego

9.2.9.1. Podstawowa aktywność

9.2.9.2. Aktywności poboczne

9.2.9.3. Wytwarzanie

Bibliografia

10. Enzymy w przetwórstwie ryb

10.1. Wprowadzenie

10.2. Proteazy

10.2.1. Zastosowania proteaz

10.2.1.1. Ekstrakcja karotenoprotein

10.2.1.2 Sos rybny

10.2.1.3 Środki aromatyzujące do ryb

10.2.1.4 Usuwanie skóry

10.2.1.5 Wydzielanie kolagenu

10.2.1.6 Hydrolizat białka

10.3. Transglutaminaza (TGaza)

10.3.1. Endogenna TGaza

10.3.2. Transglutaminaza mikrobiologiczna (MTGaza)

10.3.2.1. Wykorzystanie MTGazy w żelach surimi i ze zmielonego mięsa ryb

10.3.2.2. Wykorzystanie MTGazy w produkcji żeli z żelatyny oraz folii

Podziękowania

Bibliografia

11. Wykorzystanie enzymów w przetwórstwie owoców i warzyw oraz ekstrakcji soków

11.1. Wprowadzenie

11.2. Budowa owoców

11.2.1. Pektyny

11.2.2. Hemicelulozy

11.2.3. Celuloza

11.2.4. Skrobia

11.3. Enzymy rozkładające pektynę

11.4. Komercyjne pektynazy

11.4.1. Wytwarzanie

11.4.2. Specyfikacje

11.4.3. Aspekty prawne

11.4.4. Mikroorganizmy modyfikowane genetycznie

11.5. Enzymy wykorzystywane w przetwórstwie owoców

11.5.1. Przetwarzanie jabłek

11.5.1.1. Koncentrat soku jabłkowego, otrzymywany z zastosowaniem prasy

11.5.1.2. Koncentrat soku jabłkowego otrzymywany z użyciem dekantera

11.5.1.3. Mętny sok jabłkowy

11.5.1.4. Koncentrat soku gruszkowego

11.5.2. Przetwarzanie owoców jagodowych

11.5.2.1. Koncentrat soku z czarnej porzeczki

11.5.2.2. Koncentrat soku truskawkowego

11.5.3. Przetwarzanie owoców tropikalnych

11.5.3.1. Proces produkcji nektaru i klarowanego koncentratu

11.5.3.2. Sok ananasowy

11.5.4. Przetwarzanie cytrusów

11.5.4.1. Płukanie pulpy

11.5.4.2. Uzyskiwanie olejków

11.5.4.3. Zmniejszanie lepkości

11.5.4.4. Klarowany koncentrat soku cytrynowego

11.5.4.5. Obieranie ze skórki i puszkowanie owoców cytrusowych

11.6. Zachowanie jędrności owoców

11.7. Przetwarzanie warzyw

11.8. Nowe trendy i wnioski końcowe

Bibliografia

12. Enzymy w przemyśle mięsnym

12.1. Wprowadzenie

12.2. Mięso jako surowiec

12.2.1. Budowa mięśni

12.2.2. Chemia i biochemia mięśni

12.2.3. Przekształcanie mięśni w mięso

12.2.4. Czynniki wpływające na przetwarzanie mięsa

12.2.4.1. Ogrzewanie

12.2.4.2. Wiązanie wody

12.2.4.3. Obróbka mechaniczna

12.3. Enzymy wykorzystywane w przetwórstwie mięsa

12.3.1. Proteazy i peptydazy

12.3.2. Lipazy

12.3.3. Transglutaminaza

12.3.4. Enzymy utleniające

12.3.5. Glutaminaza

12.4. Zmiękczanie mięsa z udziałem enzymów

12.4.1. Zastosowania enzymów do zmiękczania mięsa

12.5. Nadawanie smaku produktom mięsnym przez wykorzystanie enzymów

12.5.1. Wpływ procesów proteolizy i lipolizy na powstawanie smaku produktów mięsnych

12.5.2. Wpływ enzymów na dojrzewanie peklowanegona sucho mięsa

12.6. Inżynieria strukturalna przy użyciu enzymów sieciujących

12.6.1. Restrukturyzacja mięs niepoddawanych obróbce termicznej

12.6.2. Systemy przetworzonego mięsa

12.7. Inne zastosowania

12.8. Perspektywy na przyszłość

Bibliografia

13. Wykorzystanie enzymów w modyfikowaniu białek

13.1. Wprowadzenie

13.2. Reakcja hydrolizy

13.3. Kontrolowanie reakcji hydrolizy

13.4. Proteazy

13.5. Właściwości hydrolizowanego białka

13.5.1. Smak

13.5.2. Rozpuszczalność

13.5.3. Lepkość

13.5.4. Emulgowanie

13.5.5. Spienianie

13.5.6. Żelowanie

13.5.7. Alergenność

13.5.8. Bioaktywne peptydy

13.6. Przetwarzanie

13.6.1. Przygotowanie surowca

13.6.2. Hydroliza

13.6.3. Dezaktywacja proteaz

13.6.4. Oddzielanie białek/peptydów

13.6.5. Zagęszczanie, formulacja oraz suszenie

13.7. Hydrolizaty białka dostępne na rynku

13.8. Wnioski końcowe

Bibliografia

14. Enzymy stosowane w przetwórstwie skrobi

14.1. Wprowadzenie

14.2. Skrobia i enzymy katalizujące jej konwersję

14.3. Hydroliza skrobi

14.4. Wytwarzanie fruktozy przy użyciu izomerazy glukozowej

14.5. Izomaltooligosacharydy

14.6. Amylazy w piekarnictwie (por. rozdz. 6)

14.7. Glukanotransferazy

14.8. Cyklodekstryny

14.9. Termoodwracalna skrobia żelująca

14.10. Rozgałęzione dekstryny

14.11. Wnioski końcowe

Bibliografia

15. Wykorzystanie lipaz w produkcji składników żywności

15.1. Wprowadzenie

15.2. Biochemia enzymów

15.3. Interestryfikacja

15.4. Uwodornianie i interestryfikacja chemiczna

15.5. Interestryfikacja enzymatyczna

15.5.1. Wymagania dotyczące jakości oleju

15.5.2. Poprawianie jakości oleju

15.5.3. Prowadzenie procesów EIE

15.5.4. EIE – perspektywy na przyszłość

15.6. Proces odśluzowania enzymatycznego

15.6.1. Budowa fosfolipidów oraz fosfolipazy

15.6.2. Mechanizm odśluzowania enzymatycznego

15.6.3. Rezultaty zastosowań odśluzowania enzymatycznego w przemyśle

15.6.4. Doskonalenie procesu odśluzowania enzymatycznego

15.6.5. Odśluzowanie enzymatyczne – perspektywy na przyszłość

15.7. Synteza estrów

15.8. Tłuszcze specjalne

15.9. Ekologiczne zalety procesów enzymatycznych

15.10. Przyszłe zastosowania lipaz

15.10.1. Biodiesel

15.10.2. Alternatywne systemy unieruchamiania lipaz

15.10.3. Alternatywne systemy reakcji

15.11. Wnioski końcowe

Bibliografia

Autorzy

Soottawat Benjakul

Department of Food Technology, Faculty of Agro-Industry,

Prince of Songkla University,

Thailand

Caroline H.M. van Benschop

DSM Food Specialties,

Delft, The Netherlands

Andreas Bruchmann

Technical Service Fruit Processing

Ingredients & Alcohol,

DSM Food Specialties Germany GmbH,

Germany

Johanna Buchert

VTT Technical Research Centre of Finland,

Espoo, Finland

Yves Coutel

DSM Food Specialties,

Montpellier Cedex, France

David Cowan

Novozymes UK, Chesham, UK

C´eline Fauveau

DSM Food Specialties France SAS,

France

Declan Goode

Kerry Ingredients, Kerry Group,

County Cork, Ireland

Catherine Grassin

DSM Food Specialties,

Montpellier Cedex, France

Hanne Vang Hendriksen

Novozymes, Bagsværd, Denmark

Jan D.R. Hille

DSM Food Specialties,

Delft, The Netherlands

Kaisu Honkapää

VTT Technical Research Centre of Finland,

Espoo, Finland

Sappasith Klomklao

Department of Food Science and

Technology, Faculty of Technology and

Community Development,

Thaksin University,

Phattalung, Thailand

Beate A. Kornbrust

Novozymes, Dittingen, Switzerland

Kristiina Kruus

VTT Technical Research Centre of Finland,

Espoo, Finland

Eoin Lalor

Kerry Ingredients, Kerry Group,

County Cork, Ireland

Niels Erik Krebs Lange

Novozymes, Bagsværd, Denmark

Raija Lantto

VTT Technical Research Centre of Finland,

Espoo, Finland

Barry A. Law

R & D Consultant,

Melbourne, Australia

Xiaoli Liu

Nagase ChemteX Corporation,

Kobe, Japan

Marc J.E.C. van der Maarel

TNO Quality of Life, The Netherlands,

and Department of Microbiology,

Groningen Biomolecular Sciences

and Biotechnology Institute (GBB),

University of Groningen,

The Netherlands

Per Munk Nielsen

Novozymes, Bagsværd,

Denmark

Maarten van Oort

Baking Technology Group,

AB Mauri,

The Netherlands

Eero Puolanne

Food Technology, University of Helsinki,

Finland

Katariina Roininen

VTT Technical Research Centre of Finland,

Espoo, Finland

Mary Ann Stringer

Novozymes, Bagsværd, Denmark

Benjamin K. Simpson

Department of Food Science and

Agricultural Chemistry,

McGill University,

Quebec,

Canada

Robert J. Whitehurst

Baking Technology Group,

AB Mauri, UK

Słowo wstępne

W roku 1833 Payen i Persoz poddali wodny ekstrakt słodu działaniu etanolu i uzyskali w ten sposób termolabilną substancję, która powodowała hydrolizę skrobi. Można stwierdzić, że wówczas po raz pierwszy zetknięto się z „enzymami”. Określili oni swoją frakcję mianem „diastazy”, co po Grecku oznacza „rozdzielenie”. Termin „enzym”, oznaczający składową komórek drożdży przyczyniającą się do procesu fermentacji, został po raz pierwszy użyty przez Kühnego w 1878 roku jako pochodna greckiego określenia oznaczającego „w drożdżach”. Enzymy odgrywały istotną rolę przy wytwarzaniu żywności już w roku 2000 p.n.e., kiedy to Egipcjanie i Sumerowie zastosowali proces fermentacji w piwowarstwie, wytwarzaniu pieczywa oraz serów, „niedługo” zaś potem, około r. 800 p.n.e. zaczęto wykorzystywać żołądki bydła oraz enzym chymozynę przy produkcji serów.

Pod koniec pierwszego kwartału dwudziestego wieku odkryto, że enzymy są białkami i wkrótce zaczęła się ich produkcja na skalę przemysłową oraz komercyjne użycie. W roku 1982 odnotowano pierwsze wykorzystanie technologii genetycznej przy wytwarzaniu enzymów, stosując tę technologię do produkcji a-amylazy. Sześć lat później w Szwajcarii zaakceptowano i wprowadzono rekombinowaną chymozynę, co stanowiło początek wykorzystania produktów technologii genetycznej w produkcji żywności.

W Stanach Zjednoczonych technologia ta została po raz pierwszy wykorzystana na rynku enzymów stosowanych w przemyśle spożywczym w 1990 roku. W słowie wstępnym do pierwszego wydania tej książki określono enzymy jako „katalityczne białka funkcjonalne”, jak również jako przydatne i ukierunkowane czynniki, które można zaprogramować w taki sposób, aby wypełniały określone zadania, a które nie są w stanie działać, jeśli kończy się ich substrat. Zadaniem niniejszego wydania jest zarówno przedstawienie podstaw wykorzystania enzymów dla mniej wtajemniczonych, jak również aktualizacja informacji zawartych w pierwszym wydaniu książki. Dlatego też Czytelnik napotka tutaj najaktualniejsze informacje na temat współczesnych technologii wytwarzania enzymów wykorzystywanych w przemyśle spożywczym.

Nowe rozdziały zawarte w drugim wydaniu mówią o zastosowaniu enzymów do redukcji zawartości akryloamidu, w przetwórstwie rybnym oraz w produkcji mącznych wyrobów cukierniczych. Kolejnym istotnym dodatkiem jest rozdział na temat GMO oraz inżynierii białek (ang. protein engineering, PE), służącej do modyfikacji DNA w komórkach organizmów wytwarzających enzymy. Technologia ta imituje mutacje, które mogą wystąpić w naturze, jednakże w znacznie szybszy i bardziej ukierunkowany sposób, dzięki czemu uzyskuje się wysoko specjalistyczne oraz czystsze produkty.

Autorami rozdziałów są osoby, które nie tylko mają praktyczną wiedzę na temat enzymów, lecz są także nastawione entuzjastycznie do opisywanego zagadnienia.

Na początku przedstawiono nomenklaturę enzymów, jak również ich naturę oraz spektrum działań. Opis procesów wytwarzania enzymów został poprzedzony wyjaśnieniem, czym jest GMO i PE. Kolejne rozdziały niniejszej książki przedstawiają podstawy teoretyczne jak również praktyczne zastosowania enzymów endogennych oraz egzogennych w technologii żywności i napojów oraz opisują, w jaki sposób enzymy przyczyniają się do poprawy jakości surowców, a w jaki modyfikują zjawiska biochemiczne i fizyczne, które określa się mianem „przetwórstwa żywności”. Enzymy endogenne, obecne w surowcach, odgrywały już od dawna istotną rolę przy wytwarzaniu żywności. Jednakże obecnie enzymolodzy oraz genetycy, współpracujący z technologami spożywczymi i uwzględniający aspekty prawne oraz wymagania rynku, udoskonalili naturę w celu opracowywania wielu nowych rodzajów produktów (napojów oraz żywności), o których jeszcze niedawno nikt nie słyszał. Przykładami tych osiągnięć jest zastępowanie emulgatorów innymi substancjami, obniżanie zawartości akryloamidu oraz lepsza utylizacja odpadów po produkcji żywności.

Na koniec pragniemy podziękować wszystkim współautorom niniejszej książki za ich wkład i praktyczne ujęcie zagadnienia. Jednocześnie mamy nadzieję, że Czytelnicy będą czerpać tyle radości i entuzjazmu z tej książki, ile my mieliśmy w trakcie jej przygotowania.

Robert J. Whitehurst

Maarten van Oort

Wprowadzenie: Enzymy w przemyśle spożywczym

Maarten van Oort

Enzymy są to białka, które przyspieszają zachodzenie reakcji chemicznych. Proces ten nosi miano katalizy, a zatem enzymy katalizują reakcje chemiczne [1]. W reakcjach enzymatycznych cząsteczki obecne na początku reakcji są określane terminem substraty. Enzymy przekształcają substraty w inne cząsteczki, zwane produktami. Wszelkie zachodzące w naturze procesy potrzebują enzymów, aby ich szybkość była duża. Enzymy są selektywne względem swoich substratów i dlatego też katalizują niewiele reakcji spośród wielu możliwych.

Jak w przypadku wszystkich katalizatorów, działanie enzymów polega na obniżaniu energii aktywacji danej reakcji, co zostało przedstawione na rys. 1.1.

Katalizatory, takie jak enzymy, działają poprzez zmniejszanie różnicy energii między reagentami (A, B) a stanem przejściowym. W ten sposób dochodzi do obniżenia bariery aktywacji danej reakcji, dzięki czemu zachodzi ona znacznie szybciej.

Jeśli energia aktywacji ΔG zostanie obniżona o względnie niewielką wartość, równą 5,71 kJ mol–1 (typowe wiązanie wodorowe w wodzie ma energię o wartości 20 kJ mol–1), to nastąpi około 10-krotne zwiększenie szybkości reakcji. Obniżenie energii aktywacji ΔG o 34,25 kJ mol–1 prowadzi do uzyskania 106-krotnego przyspieszenia reakcji.

Ze względu na to, że obniżenie bariery kinetycznej przyspiesza również reakcję w odwrotnym kierunku, stan równowagi danej reakcji pozostaje bez zmian.

Analogicznie do innych katalizatorów, enzymy nie są zużywane podczas reakcji, które katalizują, ani też nie wpływają na równowagę tych reakcji. Jednakże enzymy w dużej mierze różnią się od większości katalizatorów, ponieważ są dużo bardziej specyficzne. Mimo że praktycznie wszystkie enzymy są białkami, nie wszystkie katalizatory biochemiczne są enzymami, np. niektóre cząsteczki RNA, tzw. rybozymy, również katalizują reakcje [2].

1.1. Historia

W dziewiętnastym wieku Pasteur badał prowadzoną przez drożdże fermentację cukru do alkoholu. Doszedł on do wniosku, że fermentacja jest katalizowana przez tzw. fermenty występujące w komórkach drożdży. Pasteur był zdania, że te fermenty wykazują swoją aktywność wyłącznie w żywych organizmach.

Pod koniec dziewiętnastego wieku Kühne użył po raz pierwszy terminu enzym, który pochodził od greckiego określenia „w drożdżach”, do opisu aktywności badanej wcześniej przez Pasteura.

Wyraz enzym był później wykorzystywany do odróżniania substancji nieożywionych, takich jak enzymy, które znamy współcześnie, od fermentów, przy czym termin ferment jest używany do opisu aktywności chemicznej wytwarzanej przez żywe organizmy.

Również pod koniec dziewiętnastego wieku Buchner przyczynił się do znacznego rozwoju enzymologii poprzez badania zdolności ekstraktów drożdżowych, pozbawionych żywych komórek drożdży, do fermentowania cukru. Odkrył on, że cukier fermentuje nawet w nieobecności żywych komórek drożdży.

Rysunek 1.1. Obniżanie energii aktywacji reakcji

W roku 1926 Sumner jako pierwszy uzyskał enzym w czystej postaci. Wyizolował on i skrystalizował enzym ureazę z kanawalii (ang. potoczna nazwa: jack beans).

W połowie dziewiętnastego wieku Northrop i Stanley opracowali złożoną procedurę izolacji pepsyny. Ich autorska technika strącania była odtąd wykorzystywana przy krystalizacji wielu różnych enzymów. Kilka lat później po raz pierwszy wyprodukowano enzym (proteazę) na drodze hodowli Bacillus licheniformis. Dzięki temu realne stało się wytwarzanie enzymów na szeroką skalę; był to również początek ich wykorzystywania w przemyśle.

W roku 1969 odnotowano pierwszą syntezę chemiczną enzymu. Od tej pory możliwe stało się badanie tysięcy enzymów z udziałem krystalografii rentgenowskiej oraz jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR). Ponadto wykorzystanie technik inżynierii genetycznej zwiększyło efektywność produkcji enzymów, a nawet przyczyniło się do poprawy właściwości enzymów dzięki zastosowaniu inżynierii białek oraz ewolucyjnego projektowania. W roku 2004 zaprojektowano pierwsze enzymy za pomocą komputera.

1.2. Nazewnictwo

Enzymom nadaje się nazwy zgodnie z reakcjami, które katalizują. Zazwyczaj zawierają one przyrostek „-aza” dodawany do nazwy substratu (np. glukooksydaza, enzym, który utlenia glukozę) lub też typu reakcji (np. polimeraza lub izomeraza odpowiedzialne za reakcje polimeryzacji lub izomeryzacji). Występują pewne wyjątki od tej reguły, np. nazwy pepsyna, rennina czy trypsyna. Międzynarodowa Unia Biochemii (IUB, ang. The International Union of Biochemistry) opracowała pewne standardy nazewnictwa enzymów, które zakładają, że nazwy enzymów powinny wskazywać zarówno na przekształcany substrat jak i typ katalizowanej reakcji. Szczegółowe informacje na temat nazewnictwa enzymów, proponowane przez IUB można znaleźć na stronie internetowej IUB [3].

Klasyfikacja enzymów jest oparta na rodzajach katalizowanych reakcji chemicznych. Oficjalnie wyróżnia się sześć klas enzymów:

1.3. Enzymologia

Wszystkie żywe komórki w organizmie człowieka, zwierzęcia, mikroorganizmu, rośliny itd. są miejscem występowania aktywności biochemicznej, zwanej metabolizmem. Metabolizm jest to ciągły proces przemian chemicznych i fizycznych, który trwa nieprzerwanie w żywym organizmie; polega na powstawaniu nowych tkanek, zastępowaniu starych tkanek, konwersji pokarmu w energię, wydalaniu resztek, reprodukcji – czyli tych wszystkich aktywnościach, które określa się mianem „życia” danego organizmu. Jednakże rzadko która z tych reakcji biochemicznych zachodzi spontanicznie. Kataliza enzymatyczna jest potrzebna, aby te reakcje biochemiczne mogły zajść. Z tego względu enzymy są odpowiedzialne za zachodzenie wszelkich reakcji chemicznych w żywym organizmie. Bez udziału enzymów te reakcje chemiczne zachodziłyby zbyt wolno, co utrudniałoby metabolizm.

1.3.1. Funkcje enzymów w naturze

Enzymy pełnią szereg rozmaitych funkcji w żywym organizmie. Są one niezbędne

do transdukcji sygnałów oraz regulacji cyklu komórkowego, często z udziałem kinaz oraz fosfataz [4]. Ponadto odpowiadają one za generowanie ruchu, czego przykład stanowi miozyna hydrolizująca trifosforan adenozyny (ATP), by generować skurcze mięśni jak również przepływ składników w obrębie komórki, jako element cytoszkieletu [5]. Zatem można powiedzieć, że szlaki metaboliczne w komórce są uzależnione od rodzajów i ilości enzymów obecnych w tej komórce.

Enzymy pełnią również istotną funkcję w układzie pokarmowym ssaków i innych zwierząt. Enzymy takie jak amylazy rozkładają duże cząsteczki skrobi; proteazy zaś są odpowiedzialne za rozkład dużych cząsteczek białek. Skutkiem tych reakcji jest powstawanie mniejszych fragmentów, które w łatwy sposób mogą być absorbowane w jelitach zwierząt. Cząsteczki skrobi są zbyt duże, aby możliwa była ich absorpcja, lecz dzięki działaniu enzymów dochodzi do hydrolizy łańcuchów skrobi do postaci mniejszych cząsteczek, takich jak dekstryny, maltoza oraz ostatecznie glukoza, która może być wchłaniana. Różne enzymy trawią różne substancje pokarmowe. U przeżuwaczy, które są roślinożerne, mikroorganizmy bytujące w jelitach wytwarzają enzymy takie jak celulaza, które są odpowiedzialne za rozkład celulozy obecnej w ścianach komórkowych we włóknach roślinnych [6].

Kilka enzymów może działać razem w ściśle określonej kolejności, tworząc tym samym szlaki metaboliczne. W danym szlaku metabolicznym jeden enzym przyjmuje dany produkt pochodzący od innego enzymu jako substrat. Po zakończeniu reakcji katalitycznej jej produkt trafia do kolejnego enzymu. Niekiedy więcej niż jeden enzym może katalizować tę samą reakcję równocześnie; umożliwia to bardziej złożoną regulację: na przykład przy niskiej stałej aktywności jednego enzymu, lecz indukowanej wysokiej aktywności drugiego enzymu. Enzymy decydują o tym, jakie kolejne reakcje zachodzą w szlakach metabolicznych. Bez udziału enzymów metabolizm mógłby albo nie zachodzić w powtarzalny sposób, albo nie byłby dostatecznie szybki, aby sprostać potrzebom danej komórki. Szlak metaboliczny, taki jak glikoliza, nie mógłby istnieć bez udziału enzymów. Przykładowo, glukoza może bezpośrednio reagować z ATP, przez co dochodzi do fosforylacji jednej lub kilku grup hydroksylowych, związanych z atomami węgla. Bez udziału enzymów mogą powstać różne produkty fosforylacji. Jednakże w obecności enzymu, takiego jak heksokinaza, fosforylacja przy węglu-6 w cząsteczce glukozy zachodzi wyjątkowo szybko, przyczyniając się do wytworzenia znacznie większej ilości glukozo-6-fosforanu w porównaniu z ilością produktów powstałych na drodze powolnych, niekatalizowanych reakcji. W konsekwencji sieć szlaków metabolicznych w obrębie każdej komórki zależy od zestawu funkcjonujących w nich enzymów.

1.3.2. Chemia enzymów

Enzymy są białkami globularnymi, zawierającymi od nieco ponad 60 do ponad 2500 reszt aminokwasowych, co odpowiada masie cząsteczkowej MW w przedziale 6000–250 000. Aktywność enzymów jest uzależniona od ich trójwymiarowej struktury [7]. Większość enzymów jest znacznie większa od substratów, na które oddziałuje. Dlatego też fakt, że jedynie niewielka część cząsteczki enzymu bierze udział w katalizie, jest tym bardziej niezwykły [7]. Ta niewielka część nosi nazwę miejsca aktywnego i zazwyczaj zawiera zaledwie kilka reszt aminokwasowych (3–4), które bezpośrednio uczestniczą w procesie katalitycznym. Substrat zazwyczaj ulega związaniu w bliskim sąsiedztwie lub bezpośrednio w miejscu aktywnym.

1.3.3. Specyficzność enzymów

Jedną z kluczowych, a tym samym niezwykle intrygujących właściwości enzymów, jest ich specyficzność. Niektóre enzymy cechuje specyficzność absolutna. Oznacza to, że enzymy te katalizują wyłącznie jeden określony rodzaj reakcji. Z kolei inne enzymy wykazują specyficzność w odniesieniu do określonego rodzaju wiązania chemicznego lub też grupy funkcyjnej. Zasadniczo wyróżnia się cztery różne typy specyficzności:

Rysunek 1.2. Kształty komplementarne geometrycznie

Specyficzność enzymów jest zdeterminowana przez komplementarność kształtu, ładunku i właściwości hydrofilowych/hydrofobowych cząsteczek substratów i ich trójwymiarowej struktury [8]. Przestrzenne oddziaływania enzym–substrat zostały opisane przy użyciu różnych modeli interakcji, z których najważniejsze dwa przedstawiono poniżej.

1.3.3.1. Model klucza i zamka

W roku 1894 Emil Fischer zasugerował, że specyficzność enzymu zależy od specyficznego komplementarnego kształtu geometrycznego zarówno enzymu jak i substratu (por. rys. 1.2).

Właśnie dzięki tym kształtom enzym i substrat doskonale do siebie pasują [9]. Dlatego też model ten jest często określany mianem „klucza i zamka”. Jednakże, choć model ten wyjaśnia, czym jest swoistość enzymu, nie tłumaczy jednak stabilizacji stanu przejściowego, którą umożliwiają enzymy. Zatem model klucza i zamka okazał się nieodpowiedni, a jego miejsce zastąpił model indukowanego dopasowania, który uważa się za aktualny model interakcji enzym–substrat–koenzym.

1.3.3.2. Model indukowanego dopasowania

W roku 1958 Koshland [10] zasugerował modyfikację modelu klucza i zamka: ze względu na to, że enzymy są strukturami raczej elastycznymi, kształt miejsca aktywnego ulega zmianom wskutek interakcji z substratem, jako że substrat wchodzi w interakcję z enzymem. W efekcie substrat nie wiąże się sztywno z miejscem aktywnym; grupy boczne reszt aminokwasowych, które tworzą miejsce aktywne, są umieszczane w określonych położeniach, co umożliwia enzymom spełnianie funkcji katalitycznych. W przypadku niektórych enzymów, np. glikozydazy, cząsteczka substratu również zmienia nieznacznie kształt, kiedy wchodzi do miejsca aktywnego [11]. Miejsce aktywne ulega dalszym zmianom, aż do momentu, gdy substrat jest całkowicie związany, przyjmując końcowy kształt i ładunek [12].

1.3.4. Mechanizmy działania

Enzymy mogą działać w różny sposób, przy czym każdy enzym przyczynia się do obniżenia energii potrzebnej do zajścia lub kontynuacji reakcji. Mechanizmy te można opisać następująco:

1.3.5. Kompleks enzym–substrat

Teorię wyjaśniającą katalityczne działanie enzymów zaproponował po koniec dziewiętnastego wieku Arrhenius [13]. Zasugerował on, że substrat i enzym tworzą swego rodzaju pośredni stan przejściowy, znany jako kompleks ES, co można przedstawić schematycznie w następujący sposób:

(1)

Występowanie pośrednich kompleksów ES zostało udowodnione doświadczalnie, np. przy wykorzystaniu katalazy i pochodnej nadtlenku wodoru.

Po utworzeniu pośredniego kompleksu ES reakcja przebiega dalej w kierunku powstawania produktu/ów, po zakończeniu zaś reakcji enzym powraca do wyjściowej formy.

1.3.6. Równowaga chemiczna

Wiele reakcji chemicznych nie zachodzi całkowicie do końca. Także reakcje katalizowane przez enzymy nie stanowią wyjątku od tej „reguły” i większość reakcji enzymatycznych to reakcje odwracalne.

Równowaga reakcji to rodzaj stanu stacjonarnego, który jest osiągany wówczas, gdy szybkość reakcji biegnących w odwrotnych kierunkach jest taka sama. Badania nad aktywnością enzymów dotyczą zawsze reakcji w stanie równowagi.

1.4. Kinetyka reakcji enzymatycznych

Kinetyka reakcji enzymatycznych jest podstawowym sposobem opisywania, przewidywania i obliczania, w jaki sposób enzymy wiążą substraty i przekształcają je w produkty, a także jak szybko i efektywnie zachodzi ten proces.

W ubiegłym stuleciu zaproponowano ilościowe podejście do kinetyki enzymów [14], jednakże dane doświadczalne nie były przydatne, ponieważ nie znano jeszcze wówczas logarytmicznej skali pH. Tę skalę opracowano trochę później [15] razem z koncepcją buforowania. Później, gdy zaczęto powtarzać wcześniejsze doświadczenia, udowodniono prawdziwość wyprowadzonych równań, a o kinetyce zaczęto mówić jako o kinetyce (Henriego–) Michaelisa–Menten [16]. Prace te były kontynuowane, dzięki czemu opracowano równania kinetyczne, które stosuje się po dziś dzień [17].

Model działania enzymu, po raz pierwszy wyjaśniony przez Michaelisa i Menten [16], sugeruje, że wskutek związania się wolnego enzymu z substratem dochodzi do powstania kompleksu enzym–substrat. Kompleks ten ulega transformacji, uwalniając tym samym produkt oraz wolny enzym:

(2)

(3)

Jeśli reakcje przedstawione równaniami (1) i (2) połączy się w jedną wspólną reakcję (3), to uzyskuje się model katalizy enzymatycznej. Po pierwsze, enzym (E) i substrat (S) tworzą razem kompleks ES; reakcja zachodzi w momencie, gdy substrat jest przekształcany w produkt reakcji, a później dochodzi do rozdzielenia kompleksu ES, co daje wolny enzym (E) oraz produkt (P).

Model Michaelisa–Menten zakłada, że jedynie nieznaczna ilość kompleksu ES wraca do postaci wolnego enzymu (E) i S [tj. k1 >> k–1 w równaniu (1)]. Szybkość powstawania produktu może być wyznaczona zgodnie z mechanizmem przedstawionym równaniem (2) :

szybkość powstawania produktu jest to iloczyn k2[S] (4)

Z kolei szybkość powstawania pośredniego kompleksu ES [patrz równanie (5)] może być wyznaczona na podstawie mechanizmów opisanych równaniami (1) i (2):

szybkość powstawania kompleksu ES = k1[E][S] − (k2 + k1)[ES] (5)

Jeśli założy się, że reakcja osiągnęła stan stacjonarny, czyli stężenie pośredniego kompleksu ES pozostaje niezmienne, podczas gdy stężenia reagentów i produktów zmieniają się, to równanie przedstawiające szybkość powstawania produktu jest następujące:

(6)

W równaniu (6) [E0] oznacza początkowe stężenie wolnego enzymu, [S] jest stężeniem substratu, zaś stałą specyficzną dla danego enzymu, zwaną stałą Michaelisa–Menten jest KM. Zależność pomiędzy wartością stałej KM a wartościami stałych szybkości w równaniach (1) i (2) jest opisana następującym równaniem:

(7)

Stała Michaelisa–Menten (KM) jest niezwykle istotna, ponieważ można ją wyznaczyć doświadczalnie i opisuje moc katalityczną danego enzymu. Ponadto, w oparciu o wartość KM można przewidzieć szybkość reakcji katalizowanych enzymatycznie, o ile znane są warunki początkowe (stężenia substratu i enzymu).

Główną zasługą Henriego [14] było postrzeganie reakcji enzymatycznych dwuetapowo. W pierwszym etapie substrat łączy się w sposób odwracalny z enzymem, tworząc kompleks ES. Z kolei w drugim etapie enzym katalizuje reakcję chemiczną oraz uwalnia produkt.

Enzymy są w stanie katalizować nawet kilka milionów reakcji na sekundę. Szybkość reakcji jest uzależniona od warunków środowiska oraz stężenia substratu.

W warunkach, w których zachodzi denaturacja białek, aktywność enzymatyczna ulega obniżeniu lub całkowitej eliminacji. Do warunków tych zaliczamy wysoką temperaturę, skrajne wartości pH czy też duże stężenia soli. Zwiększanie stężenia substratu przyczynia się do zwiększenia aktywności. Jednakże, aby móc uzyskać maksymalną szybkość reakcji enzymatycznej, należy zwiększać stężenie substratu aż do momentu osiągnięcia stałej szybkości kształtowania produktu. Może dojść do nasycenia, ponieważ wraz ze wzrostem stężenia substratu coraz więcej cząsteczek wolnego enzymu jest przekształcane do postaci związanej z substratem, czyli kompleksu ES.

W przypadku osiągnięcia maksymalnej szybkości (Vmax) działania enzymu wszystkie miejsca aktywne enzymu są połączone z substratem, a ilość cząsteczek kompleksu ES jest taka sama jak całkowita ilość cząsteczek enzymu. Jednakże Vmax jest tylko jedną stałą kinetyczną odnoszącą się do enzymów. Ilość substratu potrzebna do osiągnięcia określonej szybkości reakcji jest również ważna. Jest ona określona przez wartość stałej Michaelisa–Menten (KM), która odpowiada stężeniu substratu niezbędnemu, by reakcja katalizowana przez enzym osiagnęła połowę szybkości maksymalnej. Każdy enzym posiada charakterystyczną stałą KM dla danego substratu, która wskazuje, jak silne jest wiązanie substratu z enzymem. Inną przydatną stałą jest kkat, która informuje o ilości cząsteczek substratu przekształcanych w produkt przez jedno miejsce aktywne enzymu na sekundę.

Wydajność enzymu można wyrazić w postaci stosunku kkat/KM. Jest on również określany mianem stałej specyficzności i obejmuje stałe szybkości wszystkich etapów reakcji. Ze względu na to, że stała specyficzności odzwierciedla zarówno powinowactwo jak również zdolności katalityczne, jest niezwykle użyteczna przy porównywaniu różnych enzymów pomiędzy sobą bądź przy porównywaniu działania tego samego enzymu na różne substraty. Teoretyczna maksymalna wartość stałej specyficzności jest określana mianem granicy dyfuzji i wynosi około 108–109 (L mol–1 s–1). Przy tej wartości każde zderzenie enzymu z substratem skutkuje katalizą, zaś szybkość powstawania produktu nie jest ograniczana przez szybkość reakcji, lecz przez współczynnik dyfuzji. Enzymy o takich właściwościach określa się mianem katalitycznie lub kinetycznie perfekcyjnych.

1.5. Czynniki wpływające na aktywność enzymów

Znajomość podstaw kinetyki reakcji enzymatycznych jest niezbędna do zrozumienia podstawowych mechanizmów reakcji enzymatycznej jak również do wyboru właściwych metod analizy enzymów.

Jest kilka czynników, które oddziałują na szybkość, z którą zachodzą reakcje enzymatyczne. Są to temperatura, wartość pH, stężenie enzymów, stężenie substratu oraz obecność inhibitorów czy też aktywatorów.

1.5.1. Stężenie enzymu

W celu zbadania wpływu wzrostu stężenia enzymu na szybkość reakcji trzeba zastosować nadmiar substratu, żeby szybkość reakcji była niezależna od jego stężenia. W tym przypadku zmiany w ilości powstającego produktu, zaistniałe w określonym czasie, będą zależne jedynie od zawartości enzymu. Reakcje te określa się często mianem „reakcji zerowego rzędu”, ponieważ ich szybkość nie jest uzależniona od stężenia substratu i jest równa pewnej stałej k. Powstawanie produktu odbywa się z szybkością, która jest stała w ciągu określonego czasu. Zatem dodatkowe zwiększenie ilości substratu nie przełoży się na zwiększenie szybkości. Jeśli reakcja jest zerowego rzędu, to podwojenie czasu przebiegu tej reakcji skutkuje podwojeniem ilości produktu.

Ilość enzymu obecnego w środowisku reakcji jest mierzona na podstawie jego aktywności katalitycznej. Na zależność aktywności od stężenia enzymu wpływ ma szereg czynników, takich jak temperatura, wartość pH itd. Najwyższa aktywność enzymatyczna jest zazwyczaj wykazywana przy nieograniczonym stężeniu substratu.

1.5.2. Stężenie substratu

Jak wykazano doświadczalnie, jeśli ilość enzymu jest utrzymywana na stałym poziomie, a stężenie substratu wzrasta stopniowo, to szybkość reakcji również rośnie, aż do momentu osiągnięcia wartości maksymalnej. Od tego momentu ewentualny wzrost stężenia substratu nie przyczynia się do wzrostu szybkości. Przyjmuje się, że jeśli osiągnie się maksymalną szybkość reakcji, to wszystkie cząsteczki enzymu są przekształcone w kompleks ES. Wartości stałej Michaelisa wyznaczono dla wielu stosowanych powszechnie enzymów. Wielkość stałej KM informuje nas o wielu istotnych kwestiach dotyczących danego enzymu:

1.5.3. Allosteria

Allosteria lub allosteryczna regulacja enzymu jest regulacją aktywności enzymu lub innego białka, polegającą na wiązaniu cząsteczki efektora w miejscu allosterycznym białka. Miejsce allosteryczne znajduje się w innym miejscu niż miejsce aktywne enzymu. Efektory, które zwiększają aktywność enzymu, określa się mianem aktywatorów allosterycznych, te zaś, które zmniejszają aktywność białka, noszą miano inhibitorów allosterycznych. Biorąc pod uwagę sam mechanizm, to inhibicja allosteryczna jest formą inhibicji niekompetycyjnej (por. p. 1.5.6.3).

Termin allosteria pochodzi z greki, w której allos oznacza „inny”, zaś steros to „przestrzeń”, co odzwierciedla fakt, że miejsce regulatorowe jest inne od miejsca aktywnego enzymu. Regulacja allosteryczna jest naturalnym przykładem kontroli na drodze sprzężenia zwrotnego.

1.5.4. Kofaktory

Wiele enzymów wymaga obecności innych składników, tzw. kofaktorów, które są niezbędne do ich aktywności katalitycznej. Ten aktywny kompleks określa się mianem holoenzymu; jest to połączenie apoenzymu (białkowej część enzymu) z kofaktorem (koenzymem, grupą prostetyczną czy też aktywatorem w postaci jonów metali), które nosi ogólną nazwę holoenzym.

Kofaktorem może być:

Zazwyczaj kofaktory te są związane bezpośrednio w miejscu aktywnym enzymu lub blisko niego. Ponadto niektóre enzymy są w stanie dodatkowo przyłączać inne cząsteczki niż substraty czy kofaktory, takie jak cząsteczki inhibujące enzym czy zakłócające proces katalityczny. W ten sposób reakcja enzymatyczna może być regulowana na poziomie komórki. Niektóre enzymy nie potrzebują żadnych dodatkowych składników, aby móc osiągnąć pełną aktywność. Jednakże inne wymagają niebiałkowych cząsteczek zwanych kofaktorami, aby móc uzyskać właściwy poziom aktywności. Kofaktory mogą być związkami nieorganicznymi (np. jonami metali lub klasterami żelaza i siarki) jak i organicznymi (np. flawina czy hem). Kofaktory organiczne mogą występować w postaci grup prostetycznych, które są trwale połączone z enzymem, lub koenzymów, które są uwalniane z miejsca aktywnego enzymu w czasie trwania reakcji. Do koenzymów zalicza się NADH, NADPH oraz ATP. Cząsteczki te są odpowiedzialne za przenoszenie grup chemicznych pomiędzy enzymami.

Silnie połączone kofaktory występują zazwyczaj w miejscu aktywnym enzymu i biorą udział w katalizie. Na przykład flawina i hem biorą często udział w reakcjach utleniania–redukcji.

1.5.5. Koenzymy

Koenzymy są to małe cząsteczki organiczne, przenoszące grupy chemiczne z cząsteczki jednego enzymu do drugiego [18]. Niektóre z tych substancji, jak na przykład ryboflawina, tiamina oraz kwas foliowy, są witaminami. Związki te nie powstają samoistnie w organizmie i dlatego też należy je mu dostarczyć w zbilansowanej diecie. Do przenoszonych grup chemicznych zalicza się jon wodorkowy (H–) przenoszony przez NAD lub NADP+, grupę acetylową przenoszoną przez koenzym A, grupę formylową, metenylową lub metylową przenoszone przez kwas foliowy oraz grupę metylową przenoszoną przez S-adenozylometioninę.

Ze względu na to, że koenzymy są modyfikowane chemicznie wskutek działania enzymu, warto jest postrzegać koenzymy jako specjalną klasę substratów, lub drugich substratów, które są wspólne dla wielu różnych enzymów. Przykładowo, około 700 znanych enzymów wykorzystuje koenzym NADH [19].

Koenzymy są zazwyczaj regenerowalne, a ich stężenia są utrzymywane na stałym poziomie wewnątrz komórki.

1.5.6. Inhibitory

Inhibitory enzymów są to substancje, które wpływają na działanie katalityczne enzymu i prowadzą do stopniowego spowolnienia katalizy, a niekiedy nawet do całkowitego jej zatrzymania.

Większość istniejących teorii dotyczących mechanizmów inhibicji opiera się na istnieniu kompleksu ES. Do inhibicji przez substrat może dojść w przypadku nadmiernej ilości substratu w środowisku danej reakcji.

Występują trzy podstawowe typy inhibicji enzymów – kompetycyjna, niekompetycyjna oraz inhibicja przez substrat. Ponadto wyróżnia się również inhibicję mieszaną.

1.5.6.1. Inhibicja kompetycyjna

Inhibicja kompetycyjna występuje wówczas, gdy zarówno substrat jak i substancja przypominająca ten substrat zostaną dodane do enzymu. Model zamka i klucza, dotyczący katalizatorów enzymatycznych, jest wykorzystywany do wyjaśniania, dlaczego dochodzi do inhibicji.

Zgodnie z tym modelem określona część powierzchni enzymu wykazuje silne powinowactwo do substratu. Substrat jest przyłączany w taki sposób, żeby ułatwić jego konwersję w produkt reakcji. Jednakże inhibitor przypominający substrat może współzawodniczyć z substratem o pozycję w miejscu aktywnym. Jeśli inhibitor jest związany w miejscu aktywnym enzymu, to nie jest on przekształcany przez enzym. Wtedy miejsce aktywne pozostaje zablokowane. W konsekwencji obserwowana reakcja jest spowalniania, ponieważ część dostępnych miejsc aktywnych enzymu jest zajęta przez inhibitor. Jeśli obecna jest niepodobna do substratu substancja, która nie pasuje do miejsca aktywnego, to jest ona odrzucana przez enzym, który może przyłączyć substrat, dzięki czemu reakcja przebiega dalej normalnie.

W przypadku inhibicji kompetycyjnej maksymalna szybkość reakcji pozostaje bez zmian, lecz większe stężenia substratu są niezbędne do osiągnięcia tej szybkości, zwiększając tym samym KM.

1.5.6.2. Inhibicja akompetycyjna

W przypadku inhibicji akompetycyjnej inhibitor nie jest w stanie połączyć się z wolnym enzymem, lecz jedynie z kompleksem ES. Powstały kompleks EIS jest nieaktywny enzymatycznie. Ten typ inhibicji jest rzadki, ale może występować w przypadku enzymów multimerycznych.

1.5.6.3. Inhibicja niekompetycyjna

Inhibitory niekompetycyjne są to substancje, które po związaniu z enzymem powodują, że nie jest on w stanie przyłączyć substratu.

Inhibitory niekompetycyjne mogą łączyć się z enzymem w tym samym czasie co substrat; oznacza to, że nigdy nie łączą się z miejscem aktywnym. Dlatego może powstać kompleks składający się z enzymu, inhibitora oraz substratu (EIS). Obydwa kompleksy – ES oraz EIS – są nieaktywne enzymatycznie. Ze względu na to, że wpływu tego inhibitora nie można osłabić przez zastosowanie większego stężenia substratu (w przeciwieństwie do inhibicji kompetycyjnej), można zaobserwować znaczną zmianę (zmniejszenie, przyp. tłum.) Vmax. Jednakże, ponieważ substrat może w dalszym ciągu łączyć się z enzymem, KM pozostaje bez zmian.

1.5.6.4. Inhibicja mieszana

Ten typ inhibicji przypomina inhibicję niekompetycyjną z tą różnicą, że kompleks EIS ma śladową aktywność enzymatyczną.

W wielu organizmach inhibitory mogą działać jako element mechanizmu sprzężenia zwrotnego. Jeśli enzym produkuje zbyt dużą ilość danej substancji w organizmie, to substancja ta może działać jako inhibitor enzymu na początku szlaku, który ją wytwarza, powodując spowolnienie lub całkowite zatrzymanie tego szlaku w momencie uzyskania wystarczającej ilości tej substancji. Jest to przykład negatywnego sprzężenia zwrotnego. Enzymy, których aktywność jest regulowana w ten sposób, są często multimeryczne i posiadają allosteryczne miejsca wiązania dla substancji regulujących. Inhibitory nieodwracalne reagują z enzymem i tworzą kowalencyjne addukty z białkiem.

1.6. Enzymy przemysłowe

Od wieków enzymy są wykorzystywane w różnych celach, np. przy produkcji piwa i serów. Zarówno w przeszłości jak i obecnie enzymy pozyskuje się z naturalnych źródeł, takich jak tkanki roślin czy też zwierząt, co przedstawiono w tabeli 1.1. Jednakże wraz z biegiem czasu i postępem technologicznym w dziedzinie biotechnologii opracowano szereg nowszych i bardziej wydajnych rodzajów enzymów.

Tabela 1.1. Enzymy pochodzenia zwierzęcego i roślinnego, wykorzystywane w przemyśle spożywczym

Enzym

Źródło

Działanie

Zastosowanie

a-Amylaza

ziarna zbóż, np. pszenicy, jęczmienia

hydroliza skrobi do oligosacharydów

piekarnictwo, piwowarstwo (słodowanie)

b-Amylaza

słodkie ziemniaki

hydroliza skrobi do maltozy

wytwarzanie syropu słodowego

Papaina

mleczko z owoców papai

hydroliza białka zawartego w żywności i napojach

wytwarzanie syropu słodowego

Bromelaina

sok i liście ananasa

hydroliza białek zawartych w tkankach mięśniowych oraz łącznych

tenderyzacja mięsa

Ficyna

mleczko z fig

jak bromelaina

jak bromelaina oraz papaina; rzadko stosowana ze względu na wysokie koszty

Trypsyna

trzustka wołowa/wieprzowa

hydroliza białek spożywczych

wytwarzanie hydrolizatu do przyprawiania żywności (zastępowana w większości przez bakteryjne proteazy)

Chymozyna (podpuszczka)

trawieniec cielęcy

hydroliza k-kazeiny

koagulacja mleka przy wytwarzaniu serów

Pepsyna

trawieniec wołowy

jak chymozyna + wstępna hydroliza kazeiny w serach

zazwyczaj obecna wraz z chymozyną jako część podpuszczki

Lipaza/esteraza

przełyk kozy i barana; trawieniec cielęcy; trzustka wieprzowa

hydroliza triacylogliceroli (tłuszczu)

poprawa aromatu serów; modyfikacja funkcji tłuszczów dzięki interestryfikacji

Lipooksygenaza

ziarna soi

utlenianie nienasyconych kwasów tłuszczowych w mące

poprawianie parametrów ciasta chlebowego

Lizozym

białka jaj kurzych

hydroliza polisacharydów bakteryjnej ściany komórkowej

przeciwdziałanie tworzeniu gazowych produktów przy wytwarzaniu serów wskutek oddziaływania bakterii przetrwalnikujących

Laktopero-ksydaza

serwatka; siara wołowa

utlenienie jonów tiocyjanianowych do bakteriobójczych hipotiocyjanianów

sterylizacja mleka na zimno

Sukces przemysłowego zastosowania enzymów można przypisać pewnym korzyściom wynikającym z zalet enzymów w porównaniu z substancjami chemicznymi. Połą-czenie funkcji katalitycznych, swoistość oraz zdolność działania w łagodnych warunkach spowodowały, że enzymy stały się preferowanymi katalizatorami dla szeregu zastosowań.

Enzymy przeznaczone dla przemysłu są jedynie częściowo oczyszczane w przeciwieństwie do enzymów przeznaczonych do użycia diagnostycznego czy też analitycznego, które są wysoko oczyszczone. Enzymy przemysłowe są pozyskiwane z różnych źródeł, np. z roślin, zwierząt czy też mikroorganizmów, lecz większość procesów produkcji opiera się na źródłach mikrobiologicznych.

Enzymy pochodzenia mikrobiologicznego są albo pozakomórkowe, takie jak proteazy i hydrolazy glikozylowe, które dominują pod względem skali sprzedaży, albo wewnątrzkomórkowe, takie jak oksydaza glukozowa. Enzymy wewnątrzkomórkowe są zazwyczaj połączone z komórką i dlatego też niezbędne jest ich wydzielenie, chyba że cały drobnoustrój ma być użyty jako katalizator.

Prawdziwy przełom w dziedzinie enzymów nastąpił wraz z wprowadzeniem proteaz bakteryjnych do proszków do prania. Pierwsza komercyjna bakteryjna proteaza z Bacillus została wprowadzona na rynek w roku 1959, zaś pierwszy wiodący producent detergentów zaczął ją wykorzystywać około roku 1963.

Producenci enzymów przemysłowych posiadają w swojej ofercie szereg enzymów do wielu zastosowań. Szacowana wartość rynku światowego jest rzędu około 2,2 mld USD. Główne zastosowania enzymów to produkcja detergentów (30%), tekstyliów (12%), przetwórstwo skrobi (12%), piekarnictwo (11%), produkcja biopaliw (9%) oraz paszy dla zwierząt (8%), co stanowi ponad 80% zużycia enzymów wytwarzanych przemysłowo.

Produkcja enzymów przemysłowych stanowi serce biotechnologii. Postęp w dziedzinie biotechnologii oraz genomiki przyczynił się do odkrycia nowych źródeł enzymów i szczepów produkcyjnych do celów komercyjnych. Warunki działania jak również efektywność potencjalnych enzymów przemysłowych mogą być dostosowywane do potrzeb.

Enzymy wykorzystuje się nie tylko w procesach chemicznych, lecz także mechanicznych czy fizycznych. Przykładem reakcji chemicznej jest wykorzystanie amylaz w celu zastąpienia kwasu w hydrolizie skrobi.

Wykorzystanie enzymów degradujących lub modyfikujących celulozę zamiast pumeksu przy ścieraniu dżinsu stanowi idealny przykład zastąpienia procesu mechanicznego poprzez wykorzystanie enzymów. Stosowanie enzymów proteolitycznych umożliwia łatwe przeprowadzenie procesów fizycznych, wymagających wysokiej temperatury podczas prania.

Wraz z postępem w dziedzinie biotechnologii spektrum zastosowań enzymów zwiększa się z każdym dniem. Enzymy są obecnie wykorzystywane w coraz większej ilości procesów, dzięki czemu mogą zastępować procesy syntetyczne, co wcześniej nie było wykonalne na większą skalę. Przykładowo, obecnie kilka firm opracowuje nowe enzymy, umożliwiające przekształcenie biomasy celulozowej w etanol, który później byłby łączony z innymi paliwami.

Inne przykłady obejmują wykorzystanie enzymów do otrzymania cukrów ze skrobi, co z kolei umożliwiło przekształcenie produkcji syropu kukurydzianego o dużej zawartości fruktozy w przemysł o wartości wielu miliardów dolarów USA.

Większość enzymów przemysłowych jest wytwarzana przez zmodyfikowane mikroorganizmy (otrzymane z użyciem technik rekombinowanego DNA) z następujących względów:

Inżynieria białek (punkt 4. na powyższej liście) przyczynia się do poprawy właściwości enzymów pod względem m.in. odporności na utlenianie i obróbkę, zmienia specyficzność substratową, zwiększa termostabilność oraz poprawia stabilność podczas przechowywania, np. jako składników detergentów zawierających środki wybielające.

Technologia rekombinowanego DNA może też zwiększyć zastosowanie enzymów wytwarzanych przez tzw. ekstremofile. Są to mikroorganizmy, które w przeciwieństwie do drobnoustrojów mezofilnych rozwijają się w ekstremalnych warunkach. Ze względu na zdolność wzrostu w określonych warunkach wyróżnia się:

Organizmy te są w stanie wytworzyć zarówno inne enzymy niż organizmy mezofilne lub też wytworzyć enzymy o ekstremalnych właściwościach, takich jak stabilność i aktywność w ekstremalnych wartościach temperatury i pH.

1.7. Enzymy stosowane w produkcji żywności

1.7.1. Biotechnologia żywności

Przemysł spożywczy wykorzystuje szereg roślin uprawnych oraz surowców pochodzenia zwierzęcego jako bazę dla procesów produkcji, co prowadzi do uzyskania jeszcze większego spektrum produktów. Biotechnologia, wykorzystywana przy wytwarzaniu produktów spożywczych od ponad 8000 lat, zapewnia możliwość ulepszonego przetwarzania surowców w produkty końcowe. Produkty, takie jak pieczywo, napoje alkoholowe, ocet, sery, jogurty i wiele innych, wytwarza się z udziałem enzymów występujących w różnych mikroorganizmach. Obecnie biotechnologia wywiera znaczny wpływ na przemysł spożywczy poprzez wprowadzanie nowych produktów, obniżanie kosztów oraz ulepszanie stosowanych do niedawna procesów produkcyjnych. Bez wątpienia, postęp w tej dziedzinie będzie następował dalej.

Wykorzystanie dokonań biotechnologii przełożyło się na zwiększenie funkcjonalności, poprawę wartości odżywczych, właściwości sensorycznych, takich jak smak czy tekstura produktów, jak również ulepszono sam proces przetwarzania żywności dzięki zastosowaniu nowych narzędzi, takich jak enzymy, emulgatory oraz ulepszone kultury starterowe. Biotechnologia oferuje także ulepszone sposoby radzenia sobie z problemem odpadów, kwestią bezpieczeństwa żywności, jej pakowania itd.

1.7.2. Zastosowania enzymów w produkcji żywności

Enzymy są w stanie modyfikować oraz poprawiać funkcjonalne, odżywcze i sensoryczne właściwości składników oraz produktów i z tego względu znalazły liczne zastosowania przy przetwarzaniu oraz wytwarzaniu wszystkich rodzajów produktów spożywczych.

W produkcji żywności enzymy wykazują wiele zalet. Po pierwsze i najważniejsze, enzymy wykorzystuje się jako alternatywę dla tradycyjnych, chemicznych technologii. Zatem enzymy mogą zastąpić syntetyczne związki chemiczne w wielu różnych procesach. Umożliwia to osiągnięcie korzyści w zakresie ochrony środowiska ze względu na obniżenie poziomu zużycia energii jak również biodegradowalność produktów. Ponadto, biorąc pod uwagę wyższą specyficzność działania enzymów w porównaniu z chemikaliami, procesy katalizowane enzymatycznie cechuje mniejsza ilość reakcji ubocznych oraz produktów ubocznych. Dzięki temu uzyskuje się wyższą jakość produktów, jak również znacznie niższy poziom zanieczyszczenia. Enzymy są w stanie katalizować reakcje w bardzo łagodnych warunkach, dzięki czemu warunki przetwarzania nie pozbawią żywności i jej składników cennych wartości odżywczych. Na koniec należy również wspomnieć o tym, że wykorzystanie enzymów umożliwia prowadzenie procesów, które bez nich byłyby niemożliwe.

Pierwszym komercyjnym enzymem stosowanym w produkcji żywności, wytworzonym z udziałem biotechnologii, był enzym wykorzystywany przy produkcji serów. Uprzednio enzym ten był pozyskiwany z żołądków cielęcych, jagnięcych oraz młodych kóz, obecnie zaś jest on wytwarzany przez mikroorganizmy, którym wszczepiono gen tego enzymu.

Przemysł spożywczy wykorzystuje ponad 55 różnych enzymów w przetwórstwie żywności. Ilość ta będzie w dalszym ciągu rosła, ponieważ z każdym dniem uczymy się wykorzystywać różnorodność świata mikrobiologicznego, aby móc uzyskać nowe enzymy przydatne w przetwórstwie żywności. Zestawienie enzymów wykorzystywanych w przemyśle spożywczym przedstawiono tab. 1.2.

Tabela 1.2. Wykorzystanie enzymów w przemyśle spożywczym

Enzym

Źródło

Działanie

Zastosowania w przemyśle spożywczym

a-Amylaza

Aspergillus spp. Bacillus spp. Microbacterium imperiale

hydroliza skrobi pszennej

amylaza przyczynia się do zmiękczenia ciasta, zwiększenia objętości pieczywa, pomaga przy wytwarzaniu cukrów do fermentacji prowadzonej przez drożdże

a-Acetomleczan

Bacillus subtilis

przekształcanie acetomleczanu w acetoinę

skrócenie czasu dojrzewania wina poprzez uniknięcie konieczności użycia dekarboksylazy podczas wtórnej fermentacji biacetylu do acetoiny

Amyloglukozydaza

Aspergillus niger Rhizopus spp.

hydrolizuje dekstryny skrobiowe do glukozy (scukrzanie)

wytwarzanie „lekkich” piw

Aminopeptydaza

Lactococcus lactis Aspergillus spp. Rhizopus oryzae

uwalnia wolne aminokwasy z N-końca białek i peptydów

usuwanie gorzkiego posmaku hydrolizatów białkowych, przyspieszanie dojrzewania serów

Katalaza

Aspergillus niger Micrococcus luteus

rozkłada nadtlenek wodoru na wodę i tlen

usuwanie tlenu w połączeniu z oksydazą glukozową

Celulaza

Aspergillus niger Trichoderma spp.

hydrolizuje celulozę

upłynnianie owoców przy produkcji soków

Chymozyna

Aspergillus awamori Kluyveromyces lactis

hydrolizuje kazeinę

koagulacja mleka przy wytwarzaniu serów

Glukanotransferaza cyklodekstryny

Bacillus spp.

syntezuje cyklodekstryny z upłynnionej skrobi

cyklodekstryny są spożywczymi mikrokapsulantami substancji nadających kolor i smak oraz witamin

b-Galaktozydaza (laktaza)

Aspergillus spp. Kluyveromyces spp.

hydrolizuje laktozę mleczną do glukozy i galaktozy

dosładzanie mleka oraz serwatki; produkty dla osób z nietolerancją laktozy; zmniejszanie krystalizacji w lodach zawierających serwatkę; zwiększanie funkcjonalności koncentratów białek serwatki; wytwarzanie laktulozy

b-Glukanaza

Aspergillus spp. Bacillus subtilis

hydrolizuje b-glukany w zacierze piwnym

pomoc przy filtracji, zapobieganie zmętnieniu piwa

Izomeraza ksylozowa,

Actinoplanes missouriensis Bacillus coagulans Streptomyces lividans Streptomyces rubiginosus

przekształca glukozę w fruktozę

wytwarzanie syropu kukurydzianego o dużej zawartości fruktozy (środek słodzący do napojów)

Oksydaza glukozowa

Aspergillus niger Penicillium chrysogenum

utlenia glukozę do kwasu glukonowego

usuwanie tlenu z opakowań do żywności, usuwanie glukozy z białka jajka w celu zapobiegania jego brązowieniu

Hemicelulaza i ksylanaza

Aspergillus spp. Bacillus subtilis Trichoderma reesei

hydrolizuje hemicelulozy (nierozpuszczalne nieskrobiowe polisacharydy w mące)

poprawa jakości chleba poprzez ulepszanie struktury miękiszu

Lipaza i esteraza

Aspergillus spp. Candida spp. Rhizomucor miehei Penicillium roqueforti Rhizopus spp. Bacillus subtilis

hydrolizuje triacyloglicerole do kwasów tłuszczowych i glicerolu; hydrolizuje estry alkilowe do kwasów tłuszczowych oraz alkoholu

poprawa smaku serów; modyfikacja funkcji tłuszczu poprzez interestryfikację; synteza estrów smakowych

Pektynaza (poligalakturonaza)

Aspergillus spp. Penicillium funiculosum

hydrolizuje pektyny

klarowanie soków owocowych poprzez depektynizację

Pektynoesteraza

Aspergillus spp.

odłącza grupy metylowe

od reszt kwasu

galakturonowego w pektynie

zastosowanie wraz z pektynazą w technologii depektynizacji

Pentozanaza

Humicola insolens Trichoderma reesei

hydrolizuje pentozany (rozpuszczalne nieskrobiowe polisacharydy w mące pszennej)

element technologii poprawiania parametrów ciasta chlebowego

Pullulanaza

Bacillus spp. Klebsiella spp.

hydrolizuje wiązania a-1,6, które tworzą rozgałęzienia w strukturze skrobi

scukrzanie skrobi (zwiększa wydajność)

Proteaza (proteinaza)

Aspergillus spp. Rhizomucor miehei Cryphonectria parasitica Penicillium citrinum Rhizopus niveus Bacillus spp.

hydroliza kazeiny; hydroliza spożywczych białek roślinnych i zwierzęcych; hydroliza glutenu pszennego

koagulacja mleka w produkcji serów, wytwarzanie hydrolizatów do zup i produktów instant, poprawianie parametrów ciasta chlebowego

1.8. Inżynieria genetyczna

Od początku lat 1980. firmy zajmujące się wytwarzaniem enzymów wykorzystywały techniki inżynierii genetycznej, aby móc zwiększyć wydajność produkcji oraz jej jakość, jak również opracować nowe produkty. Korzyści płynące z zastosowania tej metody są widoczne zarówno dla przemysłu jak i dla konsumentów, ze względu na znaczne ulepszenia w zakresie wytwarzania enzymów, przekładające się na optymalizację procesów produkcji oraz zwiększenie jakości produktów końcowych. Jednakże postęp w tej dziedzinie w ostatnim czasie nieznacznie zwolnił ze względu na trwającą w Europie dyskusję na temat innych, bardziej kontrowersyjnych zastosowań biotechnologii – np. inżynierii genetycznej zwierząt.

1.9. Alergie powodowane przez enzymy

Jak dotąd nie opisano wystąpienia alergii na pozostałości enzymów w żywności. Zawartość pozostałości enzymów w żywności jest na tyle mała, że jest mało prawdopodobne, aby kiedykolwiek przyczyniła się do wystąpienia alergii. Podobnie jak w przypadku wszystkich białek enzymy mogą wywołać reakcje alergiczne, jeśli dana osoba byłaby narażona na ekspozycję na znaczną ilość enzymów. Z tego względu firmy produkujące enzymy wykorzystują szereg środków ostrożności, a niektóre enzymy są produkowane w postaci płynnej, granulek, kapsułek lub preparatów immobilizowanych, aby w jak największym stopniu ograniczyć ekspozycję pracowników na kontakt z enzymami.

1.10. Podsumowanie i wnioski

Począwszy od pierwszych zastosowań enzymów pozyskiwanych od zwierząt oraz roślin, enzymolodzy oraz biotechnolodzy nieustanie opracowują coraz to bardziej ulepszone enzymy, przeznaczone do wykorzystania w ściśle określonych technologiach produkcji żywności. Enzymy te umożliwiają m.in. ograniczanie lub całkowitą eliminację związków chemicznych, wykorzystywanych przy przetwarzaniu żywności, minimalizują ilość odpadów, ułatwiają prowadzenie procesów, które w innym wypadku byłyby niewykonalne lub nierentowne, poprawiają wartość odżywczą i teksturę produktów spożywczych, jak również wydłużają okres ich przydatności do spożycia. Zastosowanie najnowszych technik inżynierii białek w odniesieniu do enzymów umożliwi technologom wdrażanie coraz to bardziej zaawansowanych technologii.

Bibliografia